最近浙江大學婦產(chǎn)科醫(yī)院呂時銘、石一復(fù)等對妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血腫瘤細胞檢測方法進行研究，由于妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤起源于妊娠時胚外層的滋養(yǎng)細胞，具有增生活躍和易侵入母體血循環(huán)導致早期血行轉(zhuǎn)移的特點。該腫瘤特征性分泌的hCG是理想的腫瘤標志物，一直用于該腫瘤診斷、治療監(jiān)測與隨訪。近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，在外周血中檢出腫瘤細胞的技術(shù)得以迅速發(fā)展，但用于檢測妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤尚未見報道。是否可以利用妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞在分泌hCG時伴隨著細胞內(nèi)hCG-mRNA的表達的特點，以hCG-mRNA作為滋養(yǎng)細胞標志，檢測進入外周血中的滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞，是一個值得研究的問題，這可能有益于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷。
1、循環(huán)血中β-hCG-mRNA檢出方法的建立 熒光定量PCR融匯了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點，采用熒光定量PCR技術(shù)原理為Taman技術(shù)，根據(jù)PCR反應(yīng)動力學特點，能獲得DNA模板的準確定量結(jié)果。實驗所用引物及熒光探針均采用美國PE公司DNA熒光定量分析專用軟件設(shè)計，β-hCG基因組序列參考有關(guān)文獻，對JAR細胞的β-hCG-mRNA先行逆轉(zhuǎn)錄，而后行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明，使用本研究所設(shè)計的β-hCG-mRNA引物與熒光探針可以檢測到相當于1個JAR細胞表達的β-hCG-mRNA量，且熒光增強隨著模板濃度增加而增加，從1個細胞的模板濃度到105細胞的模板濃度呈良好的線性關(guān)系，提示本研究所設(shè)計的β-hCG-mRNA引物與熒光探針以及所用的反應(yīng)程式可有效地用于β-hCG-mRNA的檢測，是檢測β-hCG-mRNA進而推算hCG分泌細胞數(shù)量的有用方法，為研究妊娠期滋養(yǎng)細胞進入母體外周血的意義以及妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中的腫瘤細胞提供了方法學基礎(chǔ)。
2、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中檢測腫瘤細胞的意義 妊娠滋養(yǎng)細胞疾病(腫瘤)是與妊娠相關(guān)的一組疾病，包括：葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤。完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的惡變率分別為20%和5%-8%，而幾乎所用的侵蝕性葡萄胎和約占50%絨毛膜癌來自于葡萄胎。因此，葡萄胎患者被要求隨訪。惡變者具有血行轉(zhuǎn)移之特點，循環(huán)血液中存在腫瘤細胞是血行轉(zhuǎn)移的基本條件之一，然而要檢出循環(huán)血液中存在腫瘤細胞較難。
呂時銘等將已知數(shù)量的JAR細胞摻入正常外周血中，然后測定其β-hCG-mRNA的量，推算混入血液中的細胞量，并以此作為外標準，通過測定妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中β-hCG-mRNA的量，推算患者外周血中相應(yīng)腫瘤細胞的量。結(jié)果顯示，盡管FQ-PCR法可以檢測到相當于1個JAR細胞表達的mRNA量，但是當JAR細胞摻入外周血后再分離，只有在每10ml中超過102時方能檢測到，此后隨摻入JAR細胞數(shù)量的增加，F(xiàn)Q-PCR所需的循環(huán)數(shù)減少，呈現(xiàn)較好的量效線性關(guān)系，與所測得的對等數(shù)量的未摻入外周血中的JAR細胞所表達的β-hCG-mRNA的量相近，提示本研究中采用的FQ-RT-PCR能很好地定量檢測hCG-mRNA，進而推算hCG分泌細胞的數(shù)量，但從母血中富集細胞的方法尚需優(yōu)化。當然，作為一種實驗方法尚需經(jīng)特異性、靈敏度、抗干擾等多項評價，而本研究結(jié)果則為在外周血中利用細胞特異表達的hCG-mRNA檢出滋養(yǎng)細胞進行了實驗探索。另一方面也為在其他腫瘤患者外周血中檢測腫瘤細胞提供了方法學的啟示。
本研究結(jié)果雖然只在9例中4例妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者額外周血中檢測到β-hCG-mRNA，推測這些病例外周血中存在有妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞，雖然病例數(shù)所限無法從臨床分期等方面分析，但已能說明用本研究方法可能是檢測和證明妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中存在腫瘤細胞的有用手段。當然其臨床應(yīng)用價值則需要病例的積累與動態(tài)觀察。以往對滋養(yǎng)細胞的診治研究的一個重要方面是有關(guān)腫瘤標記物hCG的研究，hCG是其特異與敏感的腫瘤標志物，這對于妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的診斷與治療觀察與隨訪均有重要意義，但是外周血中測到hCG只能說明基因產(chǎn)物已分泌進入血循環(huán)，只能反映體內(nèi)是否存在滋養(yǎng)細胞，以及滋養(yǎng)細胞量的多少，并不直接反映hCG分泌細胞(滋養(yǎng)細胞)是否已進入血液循環(huán)，而外周血中β-hCG-mRNA的檢測有助于判斷是否有滋養(yǎng)細胞存在于外周血循環(huán)中，這對更加準確的診斷和治療妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤是一有價值的貢獻。在妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中測到β-hCG-mRNA只提示有較多的腫瘤細胞進入血循環(huán)，而這是否與患者的臨床分期和WHO預(yù)后評分有關(guān)，是否與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)，以及能否作為改變治療方案或進一步治療的指示性標志之一則需要多病例與長時間的病例跟蹤與預(yù)后調(diào)查，方可得出結(jié)論。鑒于妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的轉(zhuǎn)移主要為血行轉(zhuǎn)移，因此對于外周血中β-hCG-mRNA陽性者可能應(yīng)較單純hCG陽性者給予更多的關(guān)注。
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